Extracellular vesicles (EVs) are a heterogeneous group of nano-sized membrane vesicles released by all cells in vitro as well as in vivo, classified mainly on their biogenesis, size and buoyant densities in microvesicles (MVs) and exosomes (EXOs). EVs are gaining importance as a mediator of important physiological and pathological intercellular activities possibly through the transfer of their cargo (proteins, DNA and RNA) between target cells. This facilitates the spreading of the disease through the delivery of genetic material and pathogenic proteins. MVs from prion-infected neuronal cells can initiate prion propagation in uninfected cells, underlying a new mechanism of the disease propagation. The aim of this study was to isolate MVs and EXOs in plasma of Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) patients and characterize them in order to discover new biomarkers of this disease. We isolated and characterized EVs in plasma of ALS patients with the use of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA), conventional flow cytometry and image flow cytometry and proteomic technologies (Western Blotting). MVs are shed from cells by budding of a plasma membrane following specific stimulation, so they are surrounded by plasma membrane receptors and they are characterised by translocation of phosphatidylserine (PS). So markers for leukocyte (CD45), endothelial (CD31), platelet (CD61), erythrocyte (CD235a) derivation and Annexin V were investigated on MVs samples from plasma of 32 ALS, 30 Alzheimer’s Disease (AD) and 30 healthy controls by flow cytometry. Interestingly we found two groups of slow progressor ALS patients, one with high expression of CD45+ Annexin V+ MVs and one with low expression of misfolded SOD1. The slow progressor ALS patients with high expression of CD45+ MVs had high expression of misfolded SOD1 protein level compared to healthy controls. We observed high levels of CD4+/CD25+/AnnV+ MVs in plasma samples from ALS patients(MVs 2,5 particles/ul (p=0.04)) compared to controls (Mvs 0,9 particles/ul.) There is also a difference between fast and slow ALS patients using CD45RA/AnnV+(1,0 particles/ul in fast vs slow 5,4 particles/ul(p=0.02)) and CD45RO/AnnV+ (25,2 particles/ul fast vs slow 9,1 particles/ul(p=0.036)). High levels of CD4+/CD25+/AnnV+ (Tregulatory cells) MVs are found in our cohort of ALS patients. This is supporting previous finding that regulatory T-lymphocytes (Tregs) are neuroprotective in ALS (Appel,2013). In addition, our data indicates that MVs of ALS patients carry markers of naive T lymphocytes (CD45RA) and activated and memory T lymphocytes( CD45RO). Further studies are needed to understand this new role of CD45RA/AnnV+ and CD45RO/AnnV+ Mvs in the slow and fast progression group of ALS patients. This finding might indicate different steps of T cell activation.

Le vescicole extracellulari sono particelle delle dimensioni dei nanometri rilasciate nei principali biofluidi del nostro corpo tra cui sangue, urina e liquido cerebrospinale come regolatori fisiologici, e classificate secondo la loro biogenesi, le loro dimensioni e la loro densità in esosomi (EXOs), microvescicole (MVs) e corpi apoptotici. Queste vescicole sono carrier di numerose molecole tra cui proteine, DNA e RNA che possono avere sulla cellula target numerosi effetti, tra cui il coinvolgimento nella regolazione genica e nell’espressione proteica, fondamentali per le funzioni della cellula stessa. Tuttavia, il loro ruolo nei diversi compartimenti in cui vengono secrete non è ancora del tutto chiaro. A seconda del tipo di cellula da cui vengono rilasciate e dallo stato biologico a cui si trovano esposte, esercitano sia una funzione protettiva che patogenica. In questo lavoro di tesi abbiamo analizzato le MVs rilasciate nel plasma di pazienti affetti da sclerosi laterale amiotrofica (SLA) sporadica, malattia neurodegenerativa del motoneurone a esito fatale. La messa a punto del protocollo per separare MVs ed EXOs è stato particolarmente difficile a causa delle loro piccole dimensioni. Le MVs hanno dimensioni comprese tra i 100 nm e i 1.000 nm, invece gli EXOs tra i 40 nm e i 150 nm. Abbiamo separato con successo le due popolazioni con un protocollo di ultracentrifugazione e filtrazione e, successivamente, abbiamo verificato la purezza con tecniche di NanoTracking Analysis and Western Blotting. Mediante un’analisi citofluorimetrica abbiamo suddiviso le vescicole sia in base alle loro dimensioni, avvalendoci dell’uso di specifiche biglie calibrate e fluorescenti, sia in base alla positività all’Annessina V (che riconosce la fosfatidilserina). In seguito, abbiamo investigato la derivazione delle MVs positive all’Annessina V, ovvero abbiamo analizzato quali fossero di derivazione leucocitaria (CD45), eritrocitaria (CD235a), endoteliale (CD31) e piastrinica (CD61).Successivamente l’analisi è passata ad identificare mediante IFC quelle vescicole marcate per il CD4,CD8,CD25,CD45RA E CD45RO.Abbiamo quindi osservato che nei pazienti SLA, le MVs Annessina V+ erano caratterizzate prevalentemente dalla positività al marcatore leucocitario CD45. Beers et al. (2008) ha dimostrato che i pazienti SLA caratterizzati da una più rapida progressione della malattia presentano una minore concentrazione di CD4+ CD25High T regolatori, ci siamo quindi chiesti se un’elevata espressione di MVs CD45+ potesse inoltre essere associata con un più alto tasso di infiammazione legato alla formazione di complessi immunitari capaci di favorire la propagazione di tipo prionico di proteine misfoldate nelle cellule nervose. Tuttavia abbiamo osservato alti livelli di CD4 + / CD25 + / + Annv MV in campioni di plasma di pazienti affetti da SLA (MV 2,5 particelle / ul (p = 0.04)) rispetto ai controlli (MVS 0,9 particelle / ul.). Inoltre abbiamo constatato che una differenza tra pazienti affetti da SLA con una progressione veloce della malattia e quelli con una progressione lenta, respittavemante : CD45RA / Annv + (1,0 particelle / ul in fast vs slow 5,4 particelle / ul (p = 0.02)) e CD45RO / Annv + (25,2 particelle / ul in fast vs slow 9,1 particelle / ul (p = 0,036)). Questo ci ha mostrato come i linfociti regolatori T (Tregs) possono essere neuroprotettivi nella SLA (Appel, 2013). Inoltre, i nostri dati indicano che MVs di pazienti affetti da SLA portano marcatori di linfociti T naive (CD45RA) e linfociti T di memoria attivati e (CD45RO).

Isolation and Characterization of Several Extracellular Vesicles Subtypes in Amyotrophic Lateral Sclerosis

LA SALVIA, SABRINA
2017-02-28

Abstract

Le vescicole extracellulari sono particelle delle dimensioni dei nanometri rilasciate nei principali biofluidi del nostro corpo tra cui sangue, urina e liquido cerebrospinale come regolatori fisiologici, e classificate secondo la loro biogenesi, le loro dimensioni e la loro densità in esosomi (EXOs), microvescicole (MVs) e corpi apoptotici. Queste vescicole sono carrier di numerose molecole tra cui proteine, DNA e RNA che possono avere sulla cellula target numerosi effetti, tra cui il coinvolgimento nella regolazione genica e nell’espressione proteica, fondamentali per le funzioni della cellula stessa. Tuttavia, il loro ruolo nei diversi compartimenti in cui vengono secrete non è ancora del tutto chiaro. A seconda del tipo di cellula da cui vengono rilasciate e dallo stato biologico a cui si trovano esposte, esercitano sia una funzione protettiva che patogenica. In questo lavoro di tesi abbiamo analizzato le MVs rilasciate nel plasma di pazienti affetti da sclerosi laterale amiotrofica (SLA) sporadica, malattia neurodegenerativa del motoneurone a esito fatale. La messa a punto del protocollo per separare MVs ed EXOs è stato particolarmente difficile a causa delle loro piccole dimensioni. Le MVs hanno dimensioni comprese tra i 100 nm e i 1.000 nm, invece gli EXOs tra i 40 nm e i 150 nm. Abbiamo separato con successo le due popolazioni con un protocollo di ultracentrifugazione e filtrazione e, successivamente, abbiamo verificato la purezza con tecniche di NanoTracking Analysis and Western Blotting. Mediante un’analisi citofluorimetrica abbiamo suddiviso le vescicole sia in base alle loro dimensioni, avvalendoci dell’uso di specifiche biglie calibrate e fluorescenti, sia in base alla positività all’Annessina V (che riconosce la fosfatidilserina). In seguito, abbiamo investigato la derivazione delle MVs positive all’Annessina V, ovvero abbiamo analizzato quali fossero di derivazione leucocitaria (CD45), eritrocitaria (CD235a), endoteliale (CD31) e piastrinica (CD61).Successivamente l’analisi è passata ad identificare mediante IFC quelle vescicole marcate per il CD4,CD8,CD25,CD45RA E CD45RO.Abbiamo quindi osservato che nei pazienti SLA, le MVs Annessina V+ erano caratterizzate prevalentemente dalla positività al marcatore leucocitario CD45. Beers et al. (2008) ha dimostrato che i pazienti SLA caratterizzati da una più rapida progressione della malattia presentano una minore concentrazione di CD4+ CD25High T regolatori, ci siamo quindi chiesti se un’elevata espressione di MVs CD45+ potesse inoltre essere associata con un più alto tasso di infiammazione legato alla formazione di complessi immunitari capaci di favorire la propagazione di tipo prionico di proteine misfoldate nelle cellule nervose. Tuttavia abbiamo osservato alti livelli di CD4 + / CD25 + / + Annv MV in campioni di plasma di pazienti affetti da SLA (MV 2,5 particelle / ul (p = 0.04)) rispetto ai controlli (MVS 0,9 particelle / ul.). Inoltre abbiamo constatato che una differenza tra pazienti affetti da SLA con una progressione veloce della malattia e quelli con una progressione lenta, respittavemante : CD45RA / Annv + (1,0 particelle / ul in fast vs slow 5,4 particelle / ul (p = 0.02)) e CD45RO / Annv + (25,2 particelle / ul in fast vs slow 9,1 particelle / ul (p = 0,036)). Questo ci ha mostrato come i linfociti regolatori T (Tregs) possono essere neuroprotettivi nella SLA (Appel, 2013). Inoltre, i nostri dati indicano che MVs di pazienti affetti da SLA portano marcatori di linfociti T naive (CD45RA) e linfociti T di memoria attivati e (CD45RO).
Extracellular vesicles (EVs) are a heterogeneous group of nano-sized membrane vesicles released by all cells in vitro as well as in vivo, classified mainly on their biogenesis, size and buoyant densities in microvesicles (MVs) and exosomes (EXOs). EVs are gaining importance as a mediator of important physiological and pathological intercellular activities possibly through the transfer of their cargo (proteins, DNA and RNA) between target cells. This facilitates the spreading of the disease through the delivery of genetic material and pathogenic proteins. MVs from prion-infected neuronal cells can initiate prion propagation in uninfected cells, underlying a new mechanism of the disease propagation. The aim of this study was to isolate MVs and EXOs in plasma of Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) patients and characterize them in order to discover new biomarkers of this disease. We isolated and characterized EVs in plasma of ALS patients with the use of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA), conventional flow cytometry and image flow cytometry and proteomic technologies (Western Blotting). MVs are shed from cells by budding of a plasma membrane following specific stimulation, so they are surrounded by plasma membrane receptors and they are characterised by translocation of phosphatidylserine (PS). So markers for leukocyte (CD45), endothelial (CD31), platelet (CD61), erythrocyte (CD235a) derivation and Annexin V were investigated on MVs samples from plasma of 32 ALS, 30 Alzheimer’s Disease (AD) and 30 healthy controls by flow cytometry. Interestingly we found two groups of slow progressor ALS patients, one with high expression of CD45+ Annexin V+ MVs and one with low expression of misfolded SOD1. The slow progressor ALS patients with high expression of CD45+ MVs had high expression of misfolded SOD1 protein level compared to healthy controls. We observed high levels of CD4+/CD25+/AnnV+ MVs in plasma samples from ALS patients(MVs 2,5 particles/ul (p=0.04)) compared to controls (Mvs 0,9 particles/ul.) There is also a difference between fast and slow ALS patients using CD45RA/AnnV+(1,0 particles/ul in fast vs slow 5,4 particles/ul(p=0.02)) and CD45RO/AnnV+ (25,2 particles/ul fast vs slow 9,1 particles/ul(p=0.036)). High levels of CD4+/CD25+/AnnV+ (Tregulatory cells) MVs are found in our cohort of ALS patients. This is supporting previous finding that regulatory T-lymphocytes (Tregs) are neuroprotective in ALS (Appel,2013). In addition, our data indicates that MVs of ALS patients carry markers of naive T lymphocytes (CD45RA) and activated and memory T lymphocytes( CD45RO). Further studies are needed to understand this new role of CD45RA/AnnV+ and CD45RO/AnnV+ Mvs in the slow and fast progression group of ALS patients. This finding might indicate different steps of T cell activation.
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