Strumenti bioinformatici a supporto dell'identificazione di bersagli molecolari per lo sviluppo di nuovi farmaci antitumorali: applicazioni alla famiglia delle chinasi

The research activity described in this thesis has been conducted at Nerviano Medical Sciences (NMS), a research-based company dedicated to the discovery and development of innovative target drugs for the treatment of cancer. A target therapy is a drug able to block cancer growth by interfering with specific molecules (target), involved in cancer development. Typically, a target is a protein specifically or at least preferentially expressed in cancer but not in normal cells. Kinases are a family of about 500 enzymes involved in several key cellular functions, which have been often found deregulated in cancer. They are characterized by a conserved ATP-binding pocket, which can be exploited for the binding of small molecules, blocking the catalytic activity of the enzyme, thus representing ideal targets for drug development. Kinases in tumors are activated by gene mutations or by overexpression, as a consequence of copy number alteration or more complex genomic rearrangements, like gene fusions, which are rare events resulting in the overexpression of the driver kinase. In this thesis, in order to identify potential new targets for the development of novel drugs, the implementation of a tool, called KAOS (Kinase Automatic Outliers Search) is described. KAOS was specifically developed for the identification of kinases showing an outlier gene expression profile, when compared to other samples from the same tumor subtype. The tool requires in input gene expression data and uses the anomalous overexpression of a kinase as readout of the presence of a gene fusion event. In addition, the implementation of a comprehensive whole kinome expression screening, called KING-REX (KINase Gene RNA EXpression), is also described, enabling the analysis of the kinase only portion of the transcriptome, with reduced time and costs. The platform allows investigating kinase expression and identifying potential gene fusion events using a customized Illumina RNAseq targeted NGS approach (Illumina TruSeq Targeted RNA expression kit, TREx), together with an ad hoc analysis pipeline. KING-REX has been conceived for the profiling of the human “kinome” on small/medium scale Illumina sequencers, requiring reduced computational resources in terms of storage space and data processing, thus representing a rapid and cost effective kinome investigation tool in the field of kinase target identification, for applications in cancer biology. In parallel, with the development of new drugs targeting specific kinase rearrangements, it is important the development of screening and validation methods, allowing the selection of the patient population harboring a specific driver gene, for treatment prescription. With the advent of Next Generation Sequencing (NGS), the detection of specific gene fusions can benefit from the high sensitivity of target-RNAseq approaches and has been proposed as diagnostic platforms. One of these methods is the Anchored Multiplex PCR (AMP) (ArcherDx, Inc.), an NGS-based system allowing the detection of rearrangements for a selected number of kinases, without requiring the knowledge of the rearrangement partner. In this thesis the use of AMP technology is described for the analysis of colorectal cancer (CRC) clinical specimens. The use of this test allowed the identification of patients harboring novel rearrangements of the kinases NTRK and ALK in CRC patients, responsive to the treatment with entrectinib, a drug initially developed at NMS specifically targeting these kinases.

L'attività di ricerca descritta in questa tesi è stata condotta presso Nerviano Medical Sciences (NMS), un’azienda farmaceutica dedicata alla ricerca e allo sviluppo di farmaci antitumorali “mirati” o “target-therapy”. Con il termine terapia “mirata” si intende un farmaco in grado di bloccare la crescita del tumore interferendo con molecule specifiche (“target”) coinvolte nello sviluppo del tumore. In genere un “target” è una proteina espressa esclusivamente o preferenzialmente nelle cellule tumorali. Le chinasi, una famiglia di circa 500 enzimi con ruoli chiave in diverse funzioni cellulari, sono state trovate alterate in diversi tipi di tumore. Sono caratterizzate dalla presenza di una “tasca” altamente conservata in grado di legare l’ATP. Questa “tasca” può essere sfruttata per bloccare l’attività catalitica dell’enzima attraverso il legame con piccole molecole chimiche che spiazzano l’ATP. Nei tumori le chinasi sono attivate a seguito di mutazioni, overespressione o riarrangiamenti che risultano nella fusione del dominio catalitico della chinasi con un altro gene. Quest’ultimo gene, tipicamente espresso costitutivamente, è il responsabile dell’espressione anomala della chinasi in un tessuto dove normalmente non è presente. In questa tesi è descritta l’implementazione di un nuovo tool, KAOS (Kinase Automatic Outliers Search), sviluppato per identificare nuovi target chinasici. KAOS consente l’identificazione di chinasi con un profilo di espressione anomalo (“outlier”) se paragonato a quello osservato in altri campioni dello stesso tipo di tumore. Il software richiede come input dati di espressione genica ed utilizza l’espressione anormalmente alta di una chinasi come indicatore della presenza di un potenziale evento di fusione. In questa tesi è descritta inoltre l’implementazione di un sistema per la valutazione dell’espressione genica dell’intero chinoma umano, comprensivo sia una parte sperimentale, sia di un sistema dedicato all’analisi dei dati. La piattaforma, chiamata KING-REX (KINase Gene RNA EXpression), consente di analizzare la sola porzione di genoma relativa alle chinasi, con una riduzione di tempi di analisi, e di identificare potenziali eventi di fusione a carico delle chinasi. La piattaforma si basa su un approccio custom di RNAseq mirato, l’ Illumina TruSeq Targeted RNA expression kit (TREx). Il sequenziamento viene effettuato su sequenziatori Illumina di piccolo/media scala, richiedendo così risorse computazionali ridotte sia in termini di storage dei dati, sia di processamento. In parallelo allo sviluppo di nuovi farmaci ”mirati”, è importante l’implementazione di metodi di screening e di validazione che consentano la selezione dei pazienti, portatori della chinasi bersaglio del farmaco, da sottoporre a trattamento. Con le nuove tecnologie di sequenziamento, l’identificazione di specifiche fusioni geniche può beneficiare dell’altissima sensibilità degli approcci di RNAseq “mirati”, che vengono quindi sempre più proposti anche come metodi diagnostici. Uno di questi sistemi è l’Anchored Multiplex PCR (AMP) (ArcherDx, Inc.), un sistema basato sulla tecnologia NGS che consente l’identificazione di riarrangiamenti che coinvolgono una o poche chinasi, senza la necessità di conoscere il partner di fusione. In questa tesi, viene descritto l’utilizzo di questa tecnologia per l’analisi di campioni clinici di tumore colorettale (CRC) e l’identificazione di pazienti affetti da CRC portatori di due nuovi riarrangiamenti genici delle chinasi NTRK e ALK. Tumori con riarrangiamenti di NTRK e ALK sono responsivi al trattamento con entrectinib, un farmaco originariamente sviluppato presso NMS per colpire in modo specifico queste chinasi bersaglio.