Digital 3D functional atlas of the mouse ovary

Female infertility is a disease that affects an increasing number of women. Key to the development of strategies to treat female infertility is to further our understanding of folliculogenesis, oocytes maturation, together with the vasculature remodelling, particularly as they occur in their three-dimensional (3D) environment. Most of our knowledge of these processes has been obtained with approaches that alter the 3D ovary integrity, therefore altering the natural spatial organisation of the events. The main objective of my thesis work was to build an in-silico 3D model of the tiny mouse ovary, and, to this end, I designed a pipeline organised in five main steps: 1. Fixation: The first step involves ovary isolation and fixation so that it can be used for subsequent ex-vivo analyses. 2. Tomography: Computed Tomography (CT) is an X-rays based imaging method which produces a true 3D reconstruction of an object, with cubic voxels and isotropic resolution. At first, MicroCT of the adult mouse ovary allowed the identification, 3D mapping and counting of follicles from the secondary to the preovulatory, and the identification of the major vasculature. Importantly, the eight ovarian sectors, virtually segmented along the dorsal-ventral axis, houses an equal number of each follicle type, suggesting a homogeneous distribution of follicle recruitment and subsequent growth. NanoCT allowed an accurate characterisation and localisation of follicles belonging to all the stages of folliculogenesis. Also, single cells and subcellular components were clearly observable. Taken together, micro- and nanoCT analyses provide the first 3D isotropic reconstruction of the mouse ovary, well maintaining its integrity and facilitating its further analysis with the other approaches described in our pipeline. 3. Tissue Clearing: iDISCO+ combined with the 3D confocal imaging of the whole mouse ovary allowed the identification of all follicle types and of the vasculature down to the thinnest capillaries surrounding individual follicles. Thanks to the use of molecular markers, this approach opens the possibility to reveal functional information (i.e., the developmental competence of individual oocytes). 4. Mass spectrometry: MALDI Mass Spectrometry Imaging (MALDI-MSI) combined with Liquid Chromatography Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry (LC-ESI-MS/MS) allowed to investigate the proteome of the entire mouse ovary, and to identify in-situ the peptide signature of follicular types. LC-ESI-MS/MS generated a reference list of 382 proteins, 75 of which playing a key role in ovarian biology. Pricipal component analysis (PCA) comparing the MALDI-MSI mass spectra of individual follicle types with those of the entire folliculogenesis suggested a progressive change in peptide content during follicle growth from the pre-antral follicle to the fully-grown. Interestingly, statistical analysis of T8 follicles, revealed 45 proteins differentially present. Of these, 9 have a specific role in preimplantation development (e.g., maternal effect factors like DNMT1, NALP5 and KHDC3), suggesting the presence of T8 follicles with different developmental competence. 5. Histology: I developed a method, named Confocal Histology, which employs the fluorescent properties of Eosin Y together with a confocal microscopy analysis of 20 µm-thick mouse ovary histological sections, to define a topography of all the ovarian follicles, and to classify the enclosed oocytes according to their chromatin organisation. In conclusion, this multi-step work serves as proof-of-concept and set sound bases for building a digital 3D functional Atlas of the mouse ovary. In the next future, I plan to use this pipeline not only for improving our understanding of folliculogenesis dynamics in the ovary under normal conditions, but also during ageing, in the presence of pathologies or hormones/drugs treatment.

L'infertilità femminile è una malattia che colpisce un numero crescente di donne. La chiave per lo sviluppo di strategie per il suo trattamento è aumentare la nostra conoscenza su follicologenesi, maturazione degli oociti e rimodellamento vascolare, in particolare per come si verificano nel loro contesto tridimensionale (3D). La maggior parte delle informazioni su questi processi è stata ottenuta con approcci che hanno portato alla perdita dell'integrità 3D dell'ovario, alterandone così la naturale organizzazione spaziale degli eventi. L'obiettivo principale del mio lavoro di tesi è stato costruire un modello 3D in silico dell’ovario di topo e, a tal fine, ho progettato una pipeline organizzata in cinque fasi principali: 1. Fissazione: la prima fase prevede l'isolamento e la fissazione dell'ovario in modo da riutilizzarlo per le analisi ex vivo. 2. Tomografia: La micro-Computed Tomography (microCT) dell'ovario di topo adulto ha consentito l'identificazione, la mappatura 3D e la conta dei follicoli dal secondario al preovulatorio e la ricostruzione del sistema vascolare principale. I risultati hanno mostrato che gli otto settori ovarici, segmentati lungo l'asse dorso-ventrale, ospitano un numero uguale di ciascun tipo di follicolo, suggerendo una distribuzione omogenea del reclutamento e della successiva crescita. La nanoCT ha consentito la caratterizzazione a singola cellula e la localizzazione dei follicoli appartenenti a tutte le fasi della follicologenesi. Prese insieme, micro- e nanoCT forniscono la prima ricostruzione isotropica 3D dell'ovario di topo, mantenendo la sua integrità e facilitandone l’analisi con gli altri approcci della pipeline. 3. Tissue Clearing: il metodo iDISCO + combinato con l'imaging confocale 3D dell'intero ovario di topo ha permesso l'identificazione di tutti i tipi di follicoli e del sistema vascolare fino ai capillari più sottili che circondano i singoli follicoli. Grazie all'uso di marcatori molecolari, questo approccio apre la possibilità di rivelare anche informazioni funzionali (ad esempio, la competenza allo sviluppo dei singoli oociti). 4. Spettrometria di massa: L’imaging con spettrometria di massa MALDI (MALDI-MSI) combinato con la cromatografia liquida LC-ESI-MS/MS ha permesso di studiare il proteoma dell'intero ovario di topo e di identificare in situ il profilo peptidico dei tipi follicolari. La LC-ESI-MS / MS ha generato un elenco di 382 proteine, 75 delle quali svolgono un ruolo chiave nella biologia ovarica. L'analisi delle componenti principali (PCA) confrontando gli spettri di massa MALDI-MSI dei singoli tipi follicolari con quelli dell'intera follicologenesi ha suggerito un cambiamento progressivo nel contenuto di peptidi durante la crescita dal follicolo preantrale al preovulatorio. L’analisi statistica dei follicoli preovulatori T8 ha rivelato 45 proteine differentemente presenti. Di queste, 9 hanno un ruolo specifico nello sviluppo preimpianto (ad esempio, fattori ad effetto materno come DNMT1, NALP5 e KHDC3), suggerendo la presenza di follicoli T8 con diversa competenza allo sviluppo. 5. Istologia: Infine, ho sviluppato un metodo, denominato Confocal Histology, che impiega la proprietà fluorescente dell'Eosina Y insieme ad un'analisi al microscopio confocale di sezioni istologiche di ovario di topo da 20 µm per definire una topografia di tutti i follicoli e per classificare gli oociti contenuti secondo la loro organizzazione cromatinica. In conclusione, questo lavoro in più fasi serve come proof-of-concept e pone le basi per la costruzione di un Atlante funzionale 3D digitale dell'ovario di topo. Nel prossimo futuro, ho intenzione di utilizzare questa pipeline non solo per migliorare la nostra comprensione delle dinamiche della follicologenesi nell'ovaio in condizioni normali, ma anche durante l'invecchiamento, in presenza di patologie o trattamento ormonale/farmacologico.