Dysfunctional mitochondria in CPVT: the path to a new treatment?

Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia (CPVT) is an inherited arrhythmogenic disease characterized by polymorphic ventricular tachycardia induced by physical and/or emotional stress that may end up with syncope, seizures, and cardiovascular collapse. CPVT belongs to a group of inheritable disorders referred to as ‘‘channelopathies’’, caused by mutations in genes coding for channel-proteins that regulate cardiac electrical function. This disease relies on the non-physiological control of the coupling of Ca2+ release from the SR, activation of sarcomere contraction, and Ca2+ reuptake into the SR during relaxation. The dominant form of CPVT is caused by mutations in the Ryanodine Receptor (RYR2) gene that encodes a large protein that forms a homotetrameric ion channel localized in the membrane of the jSR. The design of our study stems from two studies performed on our CPVT mouse model (carrying the R4496C mutation) in which we showed the presence of mitochondrial abnormalities, their rescue through RNA-interference and the abolishment of arrhythmias by said treatment and by pharmacological activation of mitochondrial Ca2+ uptake. These observations support our main hypothesis, which is that severe RyR2 mutations combined with exposure to environmental factors may exacerbate Ca2+ release from SR, promote mitochondrial Ca2+uptake, which led to impaired mitochondrial function and contractile dysfunction. We therefore characterized the mitochondrial dysfunction and the molecular mechanisms underlying this damage and their contribution to the CPVT phenotype. We performed a study of mitochondrial structure and found that upon adrenergic stimulation there is a marked increase in mitochondrial fission in our model. These data are confirmed by Western Blot analysis of the major fusion/fission factors. We then corroborated our main hypothesis by proving that in our R4496C mice mitochondria uptake a greater quantity of the cytosolic calcium. Subsequently, we evaluated the changes in mitochondrial physiology that this increase in calcium might cause. We saw a reduction in mitochondrial respiration in the baseline condition, probably as an adaptation of the system to high calcium levels, which is overridden by adrenergic activation. This decrease in respiration is accompanied by a hyperpolarization of the mitochondrial membrane potential and a greater reliance on glucose as a metabolic substrate. In the adrenergically activated condition, the catecholamine stimulus forces an increase in respiration and fatty acid beta-oxidation. This burst of mitochondrial activity however causes a greater release of ROS, which oxidize RyR2 channels making them more susceptible to activation and therefore “leakier”. In order to prove that the event responsible for the mitochondrial alterations we observe is the excess in mitochondrial Ca2+, we decided to create a silencing molecule targeting the VDAC2 channel, which is responsible for Ca2+ uptake by mitochondria. We documented that VDAC2 is one of the main mediators of the buffering activity that mitochondria exert on cytosolic Ca2+. Indeed, myocytes with VDAC2 knockdown presented lower mitochondrial Ca2+ levels and lower mito-ROS production when compared to RyR2R4496C/WT non-treated animals. We therefore proved that in CPVT mitochondria act as a calcium buffer and that the forced uptake induces major changes in their structure and physiology. We also demonstrated the crucial role VDAC2 plays in mitochondrial calcium homeostasis and that its silencing is able to partially restore mitochondrial physiology.

La tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica (CPVT) è una malattia arritmogena ereditaria caratterizzata da una tachicardia ventricolare polimorfa indotta da stress fisico e/o emotivo. La CPVT appartiene a un gruppo di malattie ereditarie denominate "canalopatie", causate da mutazioni in geni che codificano per le proteine dei canali regolanti la funzione elettrica cardiaca, ed è collegata al controllo non fisiologico dell'accoppiamento del rilascio di Ca2+ dal SR, con l'attivazione della contrazione del sarcomero e la captazione di Ca2+ nel SR durante il rilassamento. La forma dominante di CPVT è causata da mutazioni nel gene del recettore della rianodina (RYR2) che codifica per una proteina formante un canale ionico localizzato nella membrana del jSR. Il nostro studio deriva dai due lavori eseguiti sul nostro modello murino di CPVT dominante (con mutazione R4496C) nei quali viene dimostrata la presenza di anomalie mitocondriali, il rescue di quest'ultime attraverso una terapia di RNA-interference e la riduzione dell'incidenza delle aritmie attraverso l’RNA-interference e l'attivazione farmacologica dell'assorbimento mitocondriale di Ca2+. Queste osservazioni supportano la nostra ipotesi principale, cioè che le mutazioni di RyR2 combinate con l'esposizione a fattori ambientali possono esacerbare il rilascio di Ca2+ dal SR, promuovere l'assorbimento mitocondriale di Ca2+. Quest’ultimo portata a una compromissione della funzione mitocondriale e ad una disfunzione contrattile. Abbiamo quindi caratterizzato la disfunzione mitocondriale, i meccanismi molecolari alla base del danno e il loro contributo al fenotipo della CPVT. Abbiamo eseguito uno studio della struttura mitocondriale e abbiamo scoperto che dopo la stimolazione adrenergica c'è un aumento della fissione mitocondriale nel nostro modello, dati confermati dall'analisi Western Blot dei principali fattori di fusione/fissione. Successivamente, abbiamo corroborato la nostra ipotesi principale dimostrando che nei nostri topi R4496C i mitocondri assorbono una maggiore quantità del calcio citosolico. Successivamente, abbiamo valutato i cambiamenti nella fisiologia mitocondriale che questo aumento potrebbe causare vedendo una riduzione della respirazione mitocondriale in condizione basale, dovuta ad un adattamento del sistema ai livelli elevati di calcio, che viene poi scavalcato dall'attivazione adrenergica. Questa diminuzione della respirazione è accompagnata da un'iperpolarizzazione del potenziale della membrana mitocondriale e da una maggiore dipendenza dal glucosio come substrato metabolico. Nella condizione di attivazione adrenergica, lo stimolo delle catecolamine forza un aumento della respirazione e della beta-ossidazione degli acidi grassi. Questa esplosione di attività mitocondriale provoca un maggiore rilascio di ROS, che ossidano i canali RyR2 rendendoli più suscettibili all'attivazione. Per dimostrare che l'evento responsabile delle alterazioni osservate è l'eccesso di Ca2+ mitocondriale, abbiamo creato una molecola di silenziamento mirata al canale VDAC2, responsabile dell'assorbimento mitocondriale di Ca2+. Abbiamo documentato che VDAC2 è uno dei principali mediatori dell'attività tampone che i mitocondri esercitano sul Ca2+ citosolico. Di fatti, i cardiomiociti con VDAC2 silenziato presentavano livelli di Ca2+ mitocondriale inferiori e una produzione di mito-ROS inferiore rispetto agli animali non trattati. Abbiamo quindi dimostrato che: nella CPVT i mitocondri agiscono come un tampone di calcio e che questo induce cambiamenti importanti sia nella loro struttura che nella fisiologia e che VDAC2 gioca un ruolo nell'omeostasi del calcio mitocondriale.