Design and proof-of-concept of a novel CRISPR activation (CRISPRa) approach in bacteria, based on synthetic circuits with engineered single-guide RNAs.

La biologia sintetica, un campo emergente che si colloca all'intersezione tra la biologia molecolare e la bioingegneria, mira a creare sistemi biologici sintetici per risolvere problemi specifici. Questa disciplina si avvale dell'accuratezza dell'ingegneria combinata con la profonda comprensione della biologia molecolare. Le applicazioni della biologia sintetica sono ampie e limitate principalmente dall'immaginazione e dalla conoscenza attuale della biologia molecolare. In questo studio, si è considerata la progettazione e sperimentazione di un nuovo metodo per affrontare un problema non ancora risolto: l'uso dello strumento di attivazione CRISPR (CRISPRa) in cellule batteriche. CRISPRa, derivato dall'interferenza CRISPR (CRISPRi), origina dal sistema CRISPR. La distinzione principale di CRISPRa rispetto a CRISPRi e CRISPR è che, fino a questo momento, CRISPRa non è stato un metodo consolidato, limitato da varie sfide significative. Esistono diversi approcci per attivare i geni con CRISPR, tuttavia tutti condividono lo stesso problema di essere estremamente sensibili alla posizione del complesso di attivazione nonché di bassa specificità ed efficienza. Una delle possibili ragioni di ciò è la rigida connessione tra il complesso CRISPR/Cas9 e la molecola di attivazione. Il sistema descritto in questo lavoro è stato progettato per superare questa limitazione e proporre un approccio alternativo. Invece di fondere direttamente il complesso CRISPR/Cas9 con il fattore di attivazione, il sistema proposto utilizza sgRNA fuso con l'RNA messaggero del fattore di attivazione, con l'obiettivo di portare il sito di produzione in prossimità del promotore del gene di interesse Invece di unire direttamente il complesso CRISPR/Cas9 al fattore di attivazione, si utilizza sgRNA fuso con l'RNA messaggero del fattore di attivazione, per avvicinare il sito di produzione al promotore del gene di interesse. Questa strategia, fattibile in ospiti batterici per l'assenza di nucleo, potrebbe creare un punto di alta concentrazione di un fattore attivatore, indipendente da strutture rigide. Durante lo studio, abbiamo sviluppato un algoritmo genetico per sintetizzare linker nucleotidici che collegano lo sgRNA di Staphylococcus aureus con l'mRNA di un fattore di attivazione. Il Cas9 di Staphylococcus aureus selezionato, a causa della sua sequenza PAM di sei nucleotidi che aumenta la precisione, è stato sottoposto a test su due fattori attivatori (rpoZ e SoxS) trovati in E. coli e promettenti secondo la letteratura. Abbiamo esaminato tre diverse sequenze di linker generate dall'algoritmo, con l'intento di valutare la fattibilità e l'efficacia di questo approccio.

Synthetic biology is a relatively novel field of science that has found its place in between of molecular biology and bioengineering. By fusion of precision of engineering approach with the knowledge of molecular biology, synthetic biology aims to produce synthetic biological systems that are able and sharpened to solve specific biological problems. The field of possible applications of synthetic biology and its products is almost limited only by the imagination of the reader (and by the current knowledge of molecular biology). This work however is focused on designing and making proof-of-concept tests of a novel approach to one of the still opened problems – CRISPR activation (CRISPRa) tool in bacterial cells. CRISPRa as a concept was born out of the CRISPR interference (CRISPRi) which at its turn takes its roots out of the CRISPR system itself. The main difference of CRISPRa from CRISPRi and CRISPR lies in fact that up to the date CRISPRa is not a well-established widely applied technology due to several important limitations. There are different approaches to activating genes with CRISPR however all of them share the same problem of being extremely sensitive to the position of the activation complex as well as low specificity and efficiency. One of the possible reasons of this is the rigid connection between CRISPR/Cas9 complex and the activation molecule. The system that is described in this work was designed to overcome this limitation and propose an alternative approach. Instead of fusing CRISPR/Cas9 complex with activation factor directly the proposed system uses sgRNA fused with the messenger RNA of the activation factor, with a goal of bringing the production site in the proximity of the promoter of gene of interest. This design can be realized in bacterial hosts due to the lack of nucleus and should create a spot of high concentration of an activator factor which is not bound directly to any rigid structures. In course of this work, we developed a genetic algorithm for nucleotide linker synthesis to fuse sgRNA of Staphylococcus aureus and mRNA of an activation factor. Cas9 of Staphylococcus aureus used in this work has an important advantage as its PAM sequence is composed of six nucleotides making the complex much more precise. Being proof-of-concept work we tested two different activator factors variants (rpoZ and SoxS) naturally present in E. coli that has shown potential in the literature, together with three different linker sequences generated by the algorithm, with an ultimate goal to understand the viability of this approach and its potential effectiveness.