Dual targeting of cell-surface tumour antigens and soluble TGF beta by CAR-T cells – a novel approach to cancer immunotherapy

Il cancro al fegato rappresenta un grave problema di salute pubblica in tutto il mondo, essendo uno dei tumori solidi che rappresentano una sfida importante (Villanueva A, 2019). Secondo le proiezioni dell’Agenzia Internazionale per la Ricerca sul Cancro (IARC), il numero di casi dovrebbe raggiungere circa un milione all’anno entro il 2025. Il tipo più diffuso di cancro primario al fegato è il carcinoma epatocellulare (HCC), che rappresenta circa 90 casi. % dei casi di cancro al fegato. Il microambiente tumorale (TME) dell'HCC è caratterizzato da una complessa interazione tra il tumore e varie componenti dell'ambiente circostante. Questo ambiente svolge un ruolo cruciale nell’iniziazione, nella crescita e nella risposta al trattamento del tumore. Vari componenti immunitari, come i linfociti infiltranti il tumore (TIL), le cellule soppressorie di derivazione mieloide (MDSC), le cellule T regolatorie (Treg) e i macrofagi associati al tumore (TAM), interagiscono dinamicamente per monitorare e combattere i tumori (Hao X. et al., 2021). Tuttavia, questa risposta immunitaria è indebolita dalla presenza di cellule immunosoppressive come MDSC, Treg e TAM, che creano un ambiente che sopprime il sistema immunitario, consentendo al tumore di eludere il rilevamento e il progresso immunitario (Chen C., Wang Z., Ding Y., Qin Y., 2023). L’avvento di cellule immunitarie effettrici (linfociti T o NK o macrofagi) armate di recettori antigenici chimerici (CAR) diretti verso gli antigeni tumorali ha mostrato un potenziale per il trattamento del cancro, ma la loro attività è transitoria e limitata a diversi tumori ematologici. In questa tesi di ricerca, riporto come l'ingegneria delle cellule T Jurkat con CAR diretti contro gli antigeni associati al tumore MICA e B7H6 nell'HCC e l'espressione di un scFv anti TGF beta solubile secreto volto a neutralizzare il TGF-beta presente nel microambiente tumorale potrebbero suggerire possibili modi di fermare la segnalazione beta del TGF e promuovere la citotossicità delle cellule T in vitro. Questa nuova generazione di CAR viene denominata ABCAR in questo lavoro e si prevede che conferisca alle cellule immunitarie un'attività antitumorale a lungo termine nel caso dei tumori solidi, che costituiscono la percentuale maggiore (>90%) dei tumori umani. In questo lavoro, le cellule T effettrici immunitarie utilizzate erano le Jurkat, che sono state trasdotte con i costrutti lentivirali, mentre le cellule tumorali bersaglio erano le HepG2. Lo studio dell'attivazione delle cellule T, della mortalità dell'HepG2, del rilascio di citochine nelle co-colture e dell'attività beta bloccante del TGF sono stati rilevanti nel supportare la mia ipotesi, come dimostrato nella sezione dei risultati.

Liver cancer is a significant public health concern worldwide, being one of the solid tumours that pose a major challenge (Villanueva A., 2019). According to projections by the International Agency for Research on Cancer (IARC), the number of cases is expected to reach approximately one million annually by 2025. The most prevalent type of primary liver cancer is Hepatocellular carcinoma (HCC), which accounts for around 90% of liver cancer cases. The Tumour Microenvironment (TME) of HCC is characterized by a complex interaction between the tumour and various components of the surrounding environment. This environment plays a crucial role in tumour initiation, growth, and treatment response. Various immune components, such as tumour-infiltrating lymphocytes (TILs), myeloid-derived suppressor cells (MDSCs), regulatory T cells (Tregs), and tumour-associated macrophages (TAMs), interact dynamically to monitor and fight tumours (Hao X. et al., 2021). However, this immune response is weakened by the presence of immunosuppressive cells like MDSCs, Tregs, and TAMs, and signalling molecules like Transforming Growth Factor beta (TGFb), which create an environment that suppresses the immune system, allowing the tumour to evade immune detection and progress (Chen C., Wang Z., Ding Y., Qin Y., 2023). The advent of effector immune cells (T or NK lymphocytes or macrophages) armed with chimeric antigen receptors (CAR) directed to tumour antigens have shown potential for cancer treatment, but still, their activity is transient and limited to several haematological tumours. In this research thesis, engineering Jurkat T cells with CARs directed against MICA and B7H6 tumour associated antigens in HCC and the expression of a secreted soluble anti TGF beta scFv aimed at neutralising TGF-beta present in the tumour microenvironment suggest possible ways of stopping TGF beta signalling and promoting T cell cytotoxicity in vitro. This new generation of CARs is referred to as ABCARs in this work and is projected to endow immune cells with long term anti-tumour activity in the case of solid tumours, which constitute the largest proportion (>90%) of human cancers. In this work, the immune effector T cells used, the Jurkats, were transduced with the lentiviral constructs and co-cultured with the target cancer cells were the HepG2. Investigating T cell activation, HepG2 mortality, cytokine release in co-cultures and TGF beta blocking activity were relevant in supporting the advantage of these constructs over conventional CARs as demonstrated in the results section.