La contemporanea overespressione di miRNA499 e miRNA133 induce il differenziamento in senso cardiomiocitario di cellule staminali pluripotenti.

Background: per ottimizzare l’efficacia di una terapia rigenerativa che utilizzi le cellule staminali è di fondamentale importanza identificare nuove strategie per promuovere il differenziamento in senso cardiomiocitario. Recentemente è stato descritto che alcuni miRNA tra cui l’1, il 133 e il 499 sono coinvolti nello sviluppo cardiaco. In particolare è noto che il miRNA499 promuove il differenziamento in cardiomiociti (CMC) di progenitori cardiomiocitari e cellule staminali cardiache umane. Non è tuttavia noto se la concomitante sovraespressione dei miRNA1 o 133 in aggiunta al miRNA499 possa ulteriormente favorire il differenziamento in CMC. Per rispondere a questa domanda abbiamo utilizzato una linea cellulare di teratocarcinoma di topo denominata P19 nota per essere in grado di differenziare in CMC in presenza di DMSO (P19 CTRL). Metodi: per monitorare il differenziamento in senso cardiogenico, le P19 sono state transdotte con un vettore lentivirale esprimente la proteina GFP sotto il controllo di un promotore attivato dalla cTnI. Il miRNA499 è stato transientemente overespresso singolarmente o in presenza dei miRNA1 o miRNA133, in aggiunta allo 0.5% di DMSO e i livelli dei miRNA maturi sono stati quantificati mediante qPCR. In primo luogo è stato contato il numero dei foci di cellule contrattili, inoltre mediante qPCR e/o western blot ed ICC abbiamo valutato i livelli di espressione di marcatori cardiaci (Nkx2.5, GATA4, MEF2c, MLC2v, Cx43 e cTnT). Infine è stata misurata in P19 la presenza di transienti di Ca++ mediati dai canali RyR (esposizione a caffeina 10 mM) e registrata l’attività contrattile spontanea in presenza di rianodina, nifedipina, 2-aminoetossidifenilborato o in assenza di Ca++ extracellulare. Risultati: l’overespressione del solo miRNA499 aumenta significativamente di 1.7 volte (p<0.05) il numero di CMC che si contraggono in maniera spontanea rispetto alle P19 CTRL. L’associazione miRNA133+499 aumenta ulteriormente il numero di nuclei contrattili (2.02 volte vs P19 CTRL, p<0.01) anche se non risulta significativamente superiore al solo miRNA499. La qPCR ha confermato che in presenza dei miRNA133+499 i livelli di espressione di GATA4, Nkx2.5, Cx43 e cTnT sono significativamente superiori rispetto alle P19 CTRL (p<0.05 e p<0.01), inoltre i livelli di espressione di MEF2c e MLC2v sono significativamente superiori anche a quelli ottenuti in presenza del solo miRNA499 (p<0.05). Le analisi western blot e ICC hanno confermato tale aumento. Infine la risposta alla caffeina è aumentata in maniera significativa di 2.6 volte nelle P19 coltivate in presenza della combinazione miRNA133+499 rispetto alle P19 CTRL (32.5 vs 12.5%, p<0.05) ed è strettamente correlata all’attivazione del promotore cardiaco cTnI. Inoltre, l’attività contrattile spontanea scompare in assenza di Ca++ extracellulare, o in presenza di rianodina o nifedipina. Osservazioni preliminari ci hanno inoltre permesso di evidenziare che la concomitante overespressione dei miRNA133+499 si associa ad una più precoce attivazione del promotore cTnI specifico. Conclusioni: la concomitante overespressione di miRNA133 e miRNA499 è in grado di aumentare in maniera significativa il differenziamento in senso cardiomiocitario di cellule multipotenti come dimostrato dall’aumentata espressione di marcatori coinvolti nel differenziamento cardiaco (Nkx2.5, GATA4, MEF2c, MLC2v, Cx43 e cTnT). Inoltre, gli studi funzionali condotti dimostrano che i foci contrattili posseggono caratteristiche compatibili con l’accoppiamento eccitazione-contrazione tipico cardiaco.